Après 25 jours d'incubation statique à 28 °C, la laccase de *Pleurotus ostreatus* NRC620 a présenté l'activité la plus élevée dans le milieu de culture fongique. Le pH et la température optimaux pour cette enzyme étaient respectivement de 3,0 et 70 °C. Après 2 heures d'incubation à 40 °C et 50 °C, l'activité enzymatique conservait respectivement 68,33 % et 59,61 % de son activité initiale. Après 2 heures d'incubation dans un tampon citrate-phosphate (pH 7,0), l'activité enzymatique restait à 100 %. L'ajout de 10 mM de MgSO₄ et de CuSO₄ augmentait l'activité enzymatique d'environ 21 % et 35 % respectivement, tandis que NaCl, MnCl₂, KCl et CaCl₂ l'inhibaient. En utilisant l'ABTS comme substrat, les paramètres cinétiques (Km et Vmax) de la laccase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 étaient respectivement de 1,99 mM et 16 217 μmol min−1 L−1. Le traitement enzymatique d'échantillons de jus de pomme a significativement réduit le pH et la viscosité, et cette réduction était corrélée à une augmentation de la durée de conservation. Le traitement à la laccase a induit une légère diminution de la teneur totale en composés phénoliques du jus de pomme, sans toutefois affecter l'activité antioxydante.
Ces dernières années, les chercheurs se sont intéressés à l'application des biotechnologies vertes dans l'industrie agroalimentaire. La laccase est l'une des enzymes les plus utiles dans ce secteur, trouvant des applications dans des domaines tels que la transformation des jus de fruits, la boulangerie, la stabilisation du vin et l'amélioration des qualités organoleptiques des produits alimentaires.1De nombreuses plantes supérieures et micro-organismes sécrètent de la laccase,2et des champignons tels que les deutéromycètes, les ascomycètes et les basidiomycètes peuvent également produire de la laccase.3La laccase (EC 1.10.3.2) est une oxydase bleue qui réduit l'oxygène moléculaire en eau grâce à un système composé de trois atomes de cuivre différents, oxydant ainsi divers composés phénoliques et amines aromatiques. Lors de la production de jus de fruits et de légumes, le brunissement enzymatique et non enzymatique représente un problème majeur.4Ces substances altérant négativement la couleur, la saveur et l'arôme du jus, elles doivent être éliminées.5
De tous les fruits, la pomme est le plus consommé au monde et dans l'Union européenne. En 2019, la production mondiale de pommes se classait au troisième rang, dépassant les 87 millions de tonnes.6Les pommes contiennent de nombreux composés phénoliques, notamment des flavonoïdes et des acides phénoliques tels que l'acide caféique et l'acide chlorogénique.7Comme le jus de pomme est généralement consommé clair, environ 50 % à 90 % des composés phénoliques sont perdus lors du processus de filtration.8Aujourd'hui, les consommateurs privilégient les produits peu transformés, comme le jus de pomme trouble à forte teneur en polyphénols. Cependant, en raison de sa forte concentration en composés phénoliques, ce type de jus de pomme est particulièrement sensible à la décoloration et au noircissement.9Diverses technologies, notamment des méthodes de traitement thermique telles que la pasteurisation à 60–90°C, sont utilisées pour réduire ou empêcher le noircissement du jus de pomme.10Cependant, selon les recherches de Sauceda-Gálvez11Le traitement thermique peut détruire les composés volatils et altérer les qualités organoleptiques du jus de pomme. Parmi les alternatives au traitement thermique, on trouve le dioxyde de carbone supercritique, le rayonnement ultraviolet, les ultrasons, la haute pression hydrostatique ou l'homogénéisation à haute pression.12L'efficacité de ces technologies et le rendement en jus de fruits de qualité dépendent des paramètres utilisés et des caractéristiques du produit. Leur utilisation à grande échelle est limitée par des coûts élevés, des effets néfastes sur la qualité de certains produits alimentaires ou une inactivation enzymatique insuffisante.13,14
La laccase peut être utilisée pour stabiliser et clarifier les jus de fruits.15Gökmen et al.16L'utilisation de la laccase est recommandée pour la clarification des jus de fruits car elle élimine efficacement les composés phénoliques en les convertissant en polymères ou oligomères facilement éliminables par toute membrane d'ultrafiltration. Le jus de pomme conserve ainsi une couleur et une limpidité stables jusqu'à six semaines à 50 °C. La laccase purifiée de *Trichoderma* a été immobilisée sur des billes d'alumine et utilisée pour éliminer sélectivement les composés responsables des mauvais goûts dus à la contamination microbienne du jus de pomme.17
Environ 80 à 90 % des composants volatils du jus de pomme sont des esters et des aldéhydes, qui confèrent au jus un arôme unique.18La laccase de *Trametes versicolor* a été immobilisée sur un support peu coûteux fabriqué à partir de fibres naturelles de jeunes coques de noix de coco pour la clarification du jus de pomme.19Des études antérieures ont examiné la stabilisation du jus de pomme (couleur et turbidité) en utilisant des méthodes sans enzyme ou d'immobilisation, ou en combinaison avec l'ultrafiltration.5,19Cependant, l'effet des laccases fongiques sur les propriétés physico-chimiques du jus de pomme pendant le stockage demeure incertain. Par conséquent, cette étude visait à étudier expérimentalement les modifications des propriétés physico-chimiques, de la teneur en composés phénoliques et de l'activité antioxydante du jus de pomme après traitement aux laccases fongiques et deux semaines de conservation au réfrigérateur. Les laccases ont la capacité d'oxyder les composés phénoliques, ce qui les rend prometteuses pour diverses applications industrielles, notamment la clarification des jus. Cette étude a porté sur les laccases de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, en s'intéressant aux conditions optimales de leur activité et de leur efficacité dans la clarification des jus. Bien que les recherches sur le pleurote (P. ostreatus NRC 620) soient encore limitées, des études antérieures ont examiné des enzymes provenant de diverses sources fongiques, telles que *Trametes versicolor* et *Ganoderma lucidum*. L'objectif de cette étude était d'évaluer l'application potentielle de cette enzyme dans l'industrie alimentaire et de mettre en évidence ses propriétés uniques, en particulier son pH et sa température optimaux.
L’acide 2,2′-azoxybis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS) a été acheté chez Sigma-Aldrich (Canada). Tous les autres réactifs étaient de qualité analytique.
Le Centre national de recherche, par le biais de sa collection de cultures microbiennes, a obtenu la souche connue de pleurote NRC620. Après repiquage, cette souche a été conservée sur gélose dextrose-pomme de terre inclinée à 4 °C. La méthode de préparation de l'inoculum était la suivante : un mycélium complètement développé, âgé de 10 jours, a été inoculé sur des plaques de gélose dextrose-pomme de terre et incubé à 28 °C. Après 10 jours, trois blocs de mycélium de 12 mm de diamètre ont été prélevés de la gélose à l'aide d'un emporte-pièce métallique stérile et placés dans des flacons Erlenmeyer de 250 mL contenant 50 mL de milieu de culture stérilisé (pH 5,0, comme décrit précédemment par Othman et al.).20Les cultures ont été incubées à 28 °C pendant 18 jours. Elles ont ensuite été filtrées sur papier filtre Whatman n° 1, et le surnageant obtenu a servi de source enzymatique.
L'activité de la laccase a été déterminée en utilisant l'ABTS comme substrat. Le milieu réactionnel (2 mL) contenait 500 μL d'ABTS 0,3 mM (dissous dans un tampon citrate de sodium 0,1 M, pH 4,5) et la quantité requise d'échantillon enzymatique diluée avec de l'eau distillée.21,22Étant donné que la laccase peut oxyder l'ABTS à température ambiante (28 °C ± 2), l'oxydation de l'ABTS a été déterminée en mesurant l'augmentation de l'absorbance à 420 nm (ε).420= 36 000 cm-1 M -1L’activité laccase a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre UV Agilent Cary-100. Une unité d’activité laccase était nécessaire pour oxyder 1 µmol d’ABTS par minute. La concentration protéique a été déterminée par la méthode de Bradford, en utilisant l’albumine de sérum bovin comme témoin interne.23,24
Après avoir obtenu l'enzyme de la souche de champignon pleurotes NRC 620, son activité a été mesurée à différents intervalles de culture pendant 25 jours dans des conditions statiques à 28 °C.
Afin d'étudier l'effet de la température sur l'activité de la laccase, des expériences ont été menées entre 20 et 90 °C. Avant l'ajout de l'enzyme et le début de la réaction, le tampon (citrate de sodium 0,1 M, pH 4,5) et le substrat (ABTS) ont été mélangés et incubés pendant 5 minutes à différentes températures. La thermostabilité de l'enzyme a été évaluée par incubation dans un tampon phosphate de sodium 0,05 M (pH 7,0) à 40, 50, 60 et 70 °C pendant 2 heures. L'activité résiduelle a ensuite été mesurée en utilisant le substrat ABTS.
L’effet du pH sur l’activité de la laccase a été évalué en utilisant l’ABTS comme substrat dans des tampons citrate-phosphate 0,1 M, à des pH allant de 2,5 à 7,0. La solution enzymatique a été incubée à 40 °C pendant deux heures dans des tampons citrate et Tris 0,1 M (pH 3, 4, 6 et 7) afin d’évaluer sa stabilité en fonction du pH. L’activité résiduelle avec l’ABTS comme substrat a été calculée après incubation.
La laccase a été incubée pendant 10 min dans un tampon phosphate de sodium (0,05 M, pH 7,0) contenant différents ions métalliques (Mg²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, K⁺, Na⁺ et Mn²⁺) à des concentrations respectives de 2,5 mM et 10 mM. Le substrat (ABTS) a ensuite été ajouté pour initier la réaction, et l'activité relative a été mesurée.
L'oxydation de l'ABTS par la laccase à différentes concentrations (0,025–3 mM) a été mesurée à pH 4,5 afin de déterminer les paramètres cinétiques (Vmax et Km).constantesLes paramètres de l'équation de Michaelis-Menten ont été calculés à partir d'une représentation de Lineweaver-Burk, qui représente l'inverse de la vitesse de réaction en fonction de la concentration du substrat. Les constantes cinétiques ont été calculées à partir de cette représentation à l'aide du logiciel GraphPad Prism version 6.01.
Après avoir soigneusement lavé les pommes à l'eau du robinet, celles-ci ont été coupées en deux et pressées à l'aide d'un extracteur de jus de pommes automatique Braun MP80 (fabriqué en Allemagne). Le jus a ensuite été filtré à travers quatre couches d'étamine. Aucun enzyme n'a été ajouté au groupe témoin, tandis que 2,0 % de laccase (la concentration la plus efficace testée) ont été ajoutés au jus de pommes fraîchement préparé, qui a ensuite été conservé à 4 °C pendant deux semaines.
L'acidité titrable (AT) et le pH ont été déterminés selon la méthode de Boulton et al.al.27Le pH de chaque échantillon a été mesuré à l'aide d'un pH-mètre numérique (JENWAY 3510). L'acidité titrable (AT) a été calculée par rapport à l'acide malique selon la formule suivante.
Où V et C représentent respectivement le volume (mL) et la concentration (0,1 mol/L) de la solution d'hydroxyde de sodium utilisée pour le titrage. K est le coefficient de conversion de l'acide malique, égal à 0,067, et W est la masse (g) de jus de pomme.
Les solides solubles totaux (TDSLa teneur en eau de tous les échantillons de jus a été déterminée à l'aide d'un réfractomètre de poche PAL-1 (ATAGO, Tokyo, Japon). Après chaque mesure, la lentille optique a été rincée à l'eau déminéralisée et chaque échantillon de jus de pomme a été testé trois fois. La valeur de chaque échantillon a été calculée en faisant la moyenne des trois mesures. La moyenne ± l'écart type pour chaque échantillon de jus de pomme ont également été calculés en faisant la moyenne de ces résultats.
La viscoélasticité des échantillons de jus de pomme a été évaluée à l'aide d'un viscosimètre rotatif (RV, Rheotest 2, Allemagne). L'échantillon a été placé dans le cylindre « S2 » du viscosimètre. La viscosité apparente a été déterminée par la pente de la courbe contrainte de cisaillement en fonction du taux de cisaillement, calculée à partir de la contrainte de cisaillement et des courbes correspondantes pour différents taux de cisaillement (de 1,00 à 437,4 s⁻¹). La formule de calcul de la viscosité apparente est la suivante :
Où η est la viscosité apparente (cP), τ est la contrainte de cisaillement (dyn/cm²), γ est le taux de cisaillement (sec⁻¹), et (τ) est calculé à l'aide des valeurs de couple (α) et de cylindre (Z) à l'aide de la formule suivante : τ = Z . α.
L'indice de brunissement a été déterminé selon la méthode de Meidavetal.29Un échantillon de jus de 10 ml a été centrifugé à 2750 g pendant 10 min. 5 ml du surnageant ont été mélangés à 5 ml d'éthanol à 95 %. L'absorbance du mélange a été mesurée à 420 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV Shimadzu (UV-1601 PC).
La teneur totale en composés phénoliques (TPC) a été déterminée par colorimétrie à l'aide du réactif de Folin-Ciocalteu comme décrit par Boulton et al.[27Une courbe standard d'acide gallique a été établie pour des concentrations allant de 0 à 500 mg/L (r²= 0,997). Les résultats sont exprimés en équivalents d'acide gallique (mg EAG/mL).
Ajouter 125 μL d'eau distillée et 2850 μL de solution FRAP à 25 μL de jus de pomme et laisser le mélange à l'obscurité pendant30min. Mesurer ensuite l'absorbance à 593 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV Shimadzu (UV-1601 PC). Le réactif FRAP a été préparé en mélangeant un tampon acétate 300 mM (pH 3,6), du chlorure de fer(III) 20 mM et du 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazine (TPTZ) 10 mM (dissous dans du HCl 40 mM) dans un rapport de 10:1:1. Une courbe d'étalonnage a été générée en utilisant le Trolox comme étalon (R²= 0,999), et les résultats sont exprimés en μM Trolox/mL.
L'activité antioxydante des jus traités et non traités a été déterminée à l'aide de la méthode DPPH afin d'évaluer leur capacité à piéger les radicaux libres DPPH.31Dix microlitres de jus ont été mélangés à 1 ml d'une solution de DPPH (100 μM) dans du méthanol. Après une réaction à l'obscurité pendant 30 min, l'absorbance du mélange a été mesurée à 517 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV Shimadzu (UV-1601 PC). Les résultats ont été exprimés en équivalents trolox (μM trolox/ml) d'après une courbe d'étalonnage (R2= 0,990).
Les données obtenues ont montré que la production maximale de laccase était observée chez les pleurotes NRC 620 à la fin du 18e jour de fermentation, atteignant une activité de 1302 U/L. Ce résultat a permis de déterminer la durée de culture optimale pour la production de laccase (Figure 1). Bien que la production d'enzyme ait augmenté avec la durée de culture, le taux d'augmentation n'était pas directement proportionnel à cette dernière ; après 21 jours, l'activité enzymatique n'avait augmenté que de 90 U/L (pour atteindre 1390 U/L). Par conséquent, une durée de 18 jours a finalement été retenue comme durée de culture optimale afin d'équilibrer le rendement et les avantages économiques liés à une durée de culture plus longue.
Effet du temps de culture sur le rendement en laccase chez Pleurotus ostreatus NRC 620. Trois blocs de mycélium fongique (12 mm) ont été inoculés dans 50 ml de milieu stérile puis cultivés à 28 °C pendant différentes durées.
Conformément à d'autres études, nos résultats indiquent que la période de culture idéale pour atteindre une sécrétion maximale de laccase par les champignons se situe probablement entre 7 et 36 jours.32Selon Ezike et al.33, *Trametes polyzona* WRF03 a produit la plus grande quantité de laccase à la fin du neuvième jour de fermentation, avec une activité spécifique de 1637 U/mg de protéines. De plus, Othman et al.34Il a été constaté que *Trichoderma harzianum* S7113 sécrétait une grande quantité de laccase le cinquième jour de culture. Le taux de production de laccase atteignait un pic le quatorzième jour, puis diminuait progressivement.34Bien que la sécrétion d'enzymes puisse également se produire pendant la phase de croissance principale, elle atteint généralement son maximum pendant la phase intermédiaire et est déclenchée par la consommation d'une source de carbone ou d'azote.34,35
Bien que la laccase de Pleurotus ostreatus NRC 620 ait présenté une activité élevée sur une large plage de températures, de 50 °C à 80 °C, proche de son activité maximale (69–98 %), cette dernière a été observée à 70 °C (Fig. 2a). En dehors de cette plage de températures, l'activité enzymatique a diminué aux alentours de 70 °C. Ces résultats suggèrent que l'enzyme est active à haute température, probablement parce que la température élevée augmente l'énergie cinétique de la réaction.
Effet de la température (a) et du pH (b) sur l'activité de la laccase chez *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Des températures comprises entre 20 et 90 °C ont été obtenues par pré-incubation du mélange pendant 5 min avant l'ajout de l'enzyme et le démarrage de la réaction. L'effet du pH sur l'activité de la laccase a été évalué en utilisant l'ABTS comme substrat dans des solutions tampon citrate-phosphate 0,1 M, pour des pH allant de 2,5 à 7,0.
Selon Ezike etal.33La température optimale pour la laccase de *Trametes polyzona* WRF03 est de 55 °C, soit la même que pour *Ganoderma lucidum*.laccase36et similaire à la température optimale (50 °C) pour *Trametes polyzona* KU-RNW02737laccase . Baldrian38note que, comme pour d'autres systèmes enzymatiques dégradant la lignine, la plage de température idéale pour la laccase se situe entre 50 et 70 °C.
Les résultats ont montré que l'enzyme présentait l'activité la plus élevée à pH 3,0, atteignant 94 % à pH 3,5. Cependant, elle restait active sur une large gamme de pH, de 2,5 à 7,0 (Figure 2b). De plus, son activité était supérieure en milieu acide par rapport aux milieux neutre ou alcalin. Elle se maintenait à au moins 77 % sur la gamme de pH de 2,5 à 4,5, mais n'atteignait qu'environ 38 % à pH 7,0. Le pH optimal de la laccase de *Trametes polyzona* WRF03 était de 4,533, identique à celui des laccases de *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 et *Trametes hirsuta* 41. Cependant, selon l'étude de Chairin et al.42Le pH optimal de la laccase de *Polymorpha f. sp.* WR710-1 est de 2,2, tandis que celui de la laccase de *Polymorpha f. sp.* IBL-04 est de 5,043. La liaison des anions hydroxyde (inhibiteurs de la laccase) aux atomes de cuivre de la laccase T2/T3 pourrait expliquer la diminution de l'activité de la laccase en milieu neutre ou alcalin. Ceci pourrait perturber le transfert d'électrons interne du centre T1 vers le centre T2/T3, et par conséquent…limiterl'activité enzymatique23,44
L'incubation de l'enzyme à différentes températures a révélé que la durée et la température d'incubation influençaient sa stabilité. Notamment, la laccase de *Trametes polyzona* NRC 620 a présenté une stabilité supérieure à 40 °C et 50 °C, conservant respectivement 68,33 % et 59,61 % de son activité initiale après 120 minutes (Figure 3a). En revanche, dans les mêmes conditions (40 °C et 50 °C, 120 minutes), la laccase de *Trametes polyzona* WRF03 a conservé respectivement 64,38 % et 42,92 % de son activité.33Au contraire, l'augmentation de la durée et de la température d'incubation a diminué la stabilité de la laccase de *Trametes polyzona* NRC 620 ; après une incubation de 60 minutes à 60 °C et 70 °C, son activité a diminué respectivement à 39,24 % et 1,72 % (figure 3a). Conformément aux résultats expérimentaux, la laccase de *Trametes polyzona* WRF03 a présenté une stabilité supérieure à 40 °C et 50 °C tout au long du traitement thermique.33De même, Lueangjaroenkit etal.37et Chairin etal.42Les chercheurs ont rapporté la stabilité des laccases de Trametes polyzona KURNW027 et Trametes polyzona WR710-1 à 50 °C pendant une heure. En tant que biocatalyseur utile dans divers domaines biotechnologiques, la laccase doit présenter une bonne stabilité et de bonnes performances sur une large plage de températures.
Stabilité thermostatique (a) et stabilité au pH (b) de la laccase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620. La stabilité thermostatique a été évaluée en incubant la solution enzymatique dans un tampon phosphate de sodium 0,05 M (pH 7,0) à 40, 50, 60 et 70 °C pendant 2 h. La stabilité au pH a été évaluée en incubant la solution enzymatique dans des tampons citrate et Tris 0,1 M (pH 3, 4, 6 et 7) à 40 °C pendant 2 h. L'activité résiduelle a été calculée en utilisant l'ABTS comme substrat après incubation.
Afin de déterminer les conditions optimales d'utilisation et de conservation de l'enzyme, nous avons étudié l'effet du pH sur la stabilité de la laccase. L'exposition à différents pH a significativement affecté la stabilité de la structure protéique, influençant ainsi la stabilité et l'activité de la molécule enzymatique. Les résultats ont montré que l'enzyme était moins stable en milieu acide, tandis qu'elle présentait une meilleure stabilité à des pH plus élevés (milieu neutre et alcalin). À des pH de 7,0, 6,0, 4,0 et 3,0, les taux de rétention de l'enzyme après 120 minutes étaient respectivement d'environ 100 %, 62,54 %, 52,39 % et 11,14 % (Fig. 3b). La laccase de *Strombus multisus* WRF03 a montré une stabilité plus élevée à pH neutre (5,5–6,5) et une stabilité plus faible à pH acide (inférieur à 4,0). Après 120 minutes à des valeurs de pH de 5,5, 6,0 et 6,5, les taux de rétention enzymatique étaient d'environ 82 %, 100 % et 93 %, respectivement.33Khairin et al.42ont noté que la laccase de Trametes polyzona WR710-1 était stable dans la plage de pH de 6,0 à 7,0, tandis que Sayed et al.45Les résultats ont montré que la laccase était plus stable en milieu neutre. Cependant, la laccase de Cerrena unicolor a également présenté une stabilité en milieu alcalin (pH 9,0).46Les laccases étudiées ont présenté une grande stabilité sur une large gamme de pH. Cette caractéristique pourrait s'avérer importante pour les applications industrielles.
Étant donné que certains ions métalliques exercent des effets à la fois stimulants et inhibiteurs sur l'activité enzymatique, il est essentiel de prendre en compte leurs effets dans les applications industrielles. Ceci est crucial car les ions métalliques sont des contaminants environnementaux courants susceptibles d'affecter la stabilité et la synthèse des enzymes extracellulaires.47Afin d'étudier les effets de plusieurs ions métalliques sur la laccase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, nous avons mené des expériences. Comme le montre la figure 4, selon le type de métal utilisé, l'augmentation de la concentration en ions métalliques de 2,5 mM à 10 mM a eu un effet négatif sur l'activité enzymatique. Par exemple,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, etCu²⁺pourrait stimuler et activer l'activité enzymatique, tandis queNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, etK⁺L'activité enzymatique pourrait être inhibée. À une concentration de 10 mM, les ions Cu²⁺ et Mg²⁺ se sont révélés être les activateurs les plus puissants de l'activité de la laccase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, induisant un taux d'activation d'environ 34 % et 20 %, respectivement. En revanche, à la même concentration, les ions Ca²⁺ étaient les inhibiteurs les plus puissants de la laccase, réduisant l'activité enzymatique d'environ 60 %.
Effet des ions métalliques sur l'activité de la laccase de Pleurotus ostreatus NRC 620. La laccase a été incubée pendant 10 minutes dans un tampon phosphate de sodium (0,05 M, pH 7,0) contenant différents ions métalliques à des concentrations de 2,5 mM et 10 mM. La réaction a ensuite été amorcée par l'ajout du substrat (ABTS), après quoi l'activité relative a été mesurée.
Nos résultats concordent avec ceux d'autres auteurs ayant constaté que Mg²⁺ et Cu²⁺ augmentent l'activité de *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ ont observé que la laccase de *Xylaria* sp. est stimulée, dans une certaine mesure, par les ions cuivre (Cu²⁺). Par ailleurs, Foroutanfar et al.⁴⁹ et Si et al.⁵⁰ ont mené des études similaires sur les laccases de *Paraconiothyrium variabile* et de *Trametes pubescens*, respectivement. Le site de liaison du cuivre de type II (T2) de cette enzyme peut être saturé par Cu²⁺ à une concentration donnée, ce qui pourrait expliquer la stimulation de l'activité laccase à des concentrations plus élevées de Cu²⁺³⁹. Étant donné que les laccases des champignons de la pourriture blanche sont des oxydases contenant plusieurs atomes de cuivre, les effets des ions cuivre sur l'activité de la laccase sont divers et vont de la stimulation et l'inhibition à la neutralité.⁵¹ En revanche, Zhou et al.. [52]a rapporté queCu²⁺inhibait l'activité laccase du termite souterrain de Taïwan (Odontotermes formosanus). Cependant, les laccases de Cerena sp. HYB07[53]et Clitocybe maxima[54]n'ont pas été affectés par les ions cuivre.
La spécificité du substrat était représentée par ses paramètres cinétiques (Km et Vmax) ; plus l'affinité de liaison du substrat à l'enzyme était forte, plus la valeur de Km était faible et plus la spécificité du substrat était élevée.3,21,55Les paramètres cinétiques (Km et Vmax) de la laccase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ont été déterminés à l'aide du logiciel GraphPad Prism 6.0 par la représentation de Lineweaver-Burk (Figure 5). En utilisant l'ABTS comme substrat, les résultats obtenus étaient de 1,99 mM et 16 217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,respectivement. Elsayed et al.21Les valeurs de Km pour l'oxydation de l'ABTS étaient respectivement de 0,1 mM et 0,064 mM, indiquant une forte affinité des isoenzymes Lac A et Lac B pour l'ABTS. De plus, la valeur de Vmax était de 0,182 μmol.min⁻¹et 0,603 μmolmin⁻¹, respectivement. La valeur de Km obtenue était inférieure à celle de Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM) ; de plus, leur valeur de Vmax (1429 mmol min⁻¹) l'était égalementinférieurlors de l'utilisation de l'ABTS comme substrat.33 De même, les valeurs de Km des concentrations de laccase de Lentinus squarrosulus MR13 et de Trametes sp. AH28-2 étaient respectivement de 0,0714 mM et 0,025 mM, et les valeurs de Vmax étaient de 0,0091 mM min−1 et 0,67 mM min−1 mg−1 (par rapport à l'ABTS), respectivement.56,57
L'effet de la concentration d'ABTS sur l'activité de la laccase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 a été étudié, et la représentation de Lineweaver-Burk de l'inverse de la vitesse initiale de réaction en fonction de la concentration d'ABTS a été établie. La réaction d'oxydation de l'ABTS par la laccase à différentes concentrations (0,025–3,0 mM) a été mesurée à pH 4,5 afin de déterminer les paramètres cinétiques (Vmax et Km). Les constantes cinétiques de Michaelis-Menten ont été calculées à partir de cette représentation de Lineweaver-Burk, à l'aide du logiciel GraphPad Prism 6.01.
Les enzymes clarifiantes traditionnelles, telles que les pectinases, hydrolysent les substances pectiques, réduisant ainsi la viscosité et la turbidité. Elles décomposent efficacement les polysaccharides structuraux et sont souvent utilisées en association avec d'autres enzymes, comme les cellulases et les hémicellulases, afin d'améliorer le rendement et la limpidité. Cependant, les pectinases ne ciblent pas spécifiquement les composés phénoliques, principaux responsables de la turbidité et du brunissement oxydatif, notamment dans les jus comme le jus de pomme et le jus de raisin.58À l'inverse, les laccases catalysent l'oxydation des composés phénoliques, les polymérisant en molécules plus grandes et insolubles qui peuvent être éliminées par sédimentation ou filtration. Ce mécanisme améliore non seulement la limpidité, mais prolonge également la durée de conservation du jus en réduisant le risque de brunissement oxydatif dû aux composés phénoliques. De plus, les procédés de clarification à base de laccase peuvent être mis en œuvre dans des conditions douces (pH 3,5–5,5, température 25–40 °C), ce qui les rend adaptés aux jus délicats sans altérer leurs propriétés nutritionnelles ni organoleptiques.59Des études ont montré que le traitement à la pectinase permet de clarifier le jus en 1 à 2 heures, tandis que le traitement à la laccase nécessite généralement un temps de réaction plus long (3 à 6 heures) pour réduire complètement les composés phénoliques. Ce procédé peut toutefois être optimisé par l'immobilisation de l'enzyme ou par la combinaison de la laccase avec des méthodes de clarification mécanique.60Dans cette étude, le profil enzymatique de l'extrait brut a révélé des activités significatives de laccase et d'α-amylase, tandis que les activités de pectinase et de xylanase étaient extrêmement faibles et aucune activité cellulase n'a été détectée. Par conséquent, la réduction de la turbidité et de la teneur en composés phénoliques était principalement due à l'action de la laccase, tandis que la modification de la viscosité pourrait être partiellement attribuable à l'action de l'amylase.
Le tableau 1 présente les paramètres physico-chimiques du jus de pomme fraîchement pressé et des échantillons traités à la laccase. Les résultats montrent que le rendement du jus de pomme fraîchement pressé (71,59 %) est inférieur à celui des échantillons traités à la laccase (87,34 %). Ces résultats concordent avec les observations de Pilnik et Orange.61Cette étude a montré que l'utilisation d'enzymes dans la transformation des fruits permet d'accroître le rendement en jus, d'améliorer la filtration et d'obtenir un jus clair de haute qualité, idéal pour la concentration. L'augmentation du rendement est principalement due à l'accroissement de la teneur en sucres solubles du jus. Lors de l'hydrolyse enzymatique des fruits, la mésoglée et la pectine présentes dans les parois cellulaires sont détruites et converties en substances solubles telles que des sucres neutres et des acides.62.Le pH du jus de pomme traité par enzyme était significativement inférieur à celui du groupe témoin (P < 0,05), et le pH des deux groupes a augmenté significativement au cours du stockage (Tableau 1). Ces résultats concordent avec ceux de Mark et al.63Des chercheurs ont constaté une diminution du pH du jus de noix de cajou après traitement thermique et stockage. La dégradation de la pectine et la formation d'acide galacturonique suite au traitement enzymatique pourraient expliquer cette augmentation de pH. Le pH des échantillons traités aux enzymes est resté compris entre 4,05 et 4,31 tout au long du stockage, tandis que celui du jus de pomme non traité a oscillé entre 4,12 et 4,33.
L'acidité totale (AT) des échantillons non traités et traités à la laccase a montré une tendance à la baisse avec l'augmentation de la durée de stockage (tableau 1). Cette diminution d'acidité a été attribuée à la conversion des acides organiques en glucides ou à des réactions enzymatiques, ainsi qu'à l'oxydation durant le stockage du jus.64L'acidité totale du jus de pomme témoin et des échantillons traités aux enzymes était inférieure à celle des autres jus (jus de fraise 0,9 %, jus de prune 2,2 %, jus de kumquat 1,0 %, jus d'abricot 2,4 %, jus d'orange 0,8 %), mais similaire à celle des autres jus (par exemple, jus de poire 0,3 %).62Ces différences dans le jus de pomme fraîchement pressé non traité peuvent être dues à divers facteurs tels que les conditions de culture, les facteurs génétiques, le niveau de maturité et les méthodes de transformation.65La diminution de l'acidité totale du jus de pomme témoin et du jus de pomme traité à la laccase est cohérente avec les résultats présentés par Singh et al.66concernant la diminution de l'acidité totale du jus de pomme Jin Nuo après 74 jours de stockage. D'autre part, Oshmiansky et Wojdylo67Nous n'avons constaté aucun changement significatif de l'acidité du jus de pomme lors de l'étude de l'effet des méthodes de clarification traditionnelles.
Les résultats présentés dans le tableau 1 indiquent que la teneur en solides solubles totaux (SST) du jus de pomme traité à la laccase était supérieure à celle de l'échantillon non traité. Ces résultats sont cohérents avec les études publiées.. 68De plus, le tableau 1 montre que la valeur TSS du jus de pomme témoin était de 9,58 au point de mesure initial et a atteint 11,05 à la fin de la période de stockage. Ces valeurs sont inférieures aux valeurs TSS du jus de pomme frais rapportées par Hamid et al.. 69(11,2 et 11,80, respectivement). La teneur en solides solubles totaux (SST) des échantillons de jus de pomme traités à la laccase a augmenté significativement, passant de 11,23 à 12,93 après deux semaines de conservation à 4 °C (Tableau 1). Une augmentation similaire de la teneur en SST a également été observée pour les agrumes, les citrons et les oranges douces. Cette augmentation pourrait être due à l'hydrolyse des polysaccharides (amidon) en monosaccharides (sucres), à l'augmentation de la concentration liée à la déshydratation du jus et à la dégradation de la pectine en solides solubles. L'augmentation de la teneur en solides solubles est probablement due à l'accroissement de la concentration en sucres solubles, qui peuvent provenir de la conversion de la pectine ou de la cellulose en sucres solubles par la pectine ou la cellulase, respectivement, ou de l'hydrolyse de l'amidon en sucres, comme l'ont rapporté Hamed et al.69.L'effet de la laccase sur les propriétés du jus de pomme est observable visuellement : le jus traité à la laccase présente une meilleure fluidité et une viscosité plus faible que le jus non traité. Cette observation est consignée dans le tableau 1. La viscosité de l'échantillon traité à l'enzyme était de 1,87 cP, tandis que celle de l'échantillon témoin était de 2,95 cP. Cette diminution significative de la viscosité est probablement due à la plus grande capacité de rétention d'eau des substances de type pectine et à la formation d'une structure de réseau cohésive.
Dans cette étude, l'effet de la laccase sur l'indice de brunissement (IB) du jus de pomme a été étudié en mesurant l'absorbance à 420 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. Au cours du stockage, l'IB des échantillons de jus de pomme, traités ou non, a montré une augmentation progressive. L'IB reflète le degré de brunissement et peut servir deun importantIndicateur des réactions de brunissement enzymatiques et non enzymatiques. L'absorbance a augmenté significativement au cours du stockage (P < 0,05). À la fin du stockage,A420La valeur des échantillons de jus de pomme des groupes témoin et traité aux enzymes a augmenté d'environ 217 % et 121 %, respectivement (tableau 1). Ces résultats indiquent que le traitement enzymatique permet de réduire efficacement le brunissement d'environ 56 %. Ces résultats concordent avec ceux de Bezerra et al.[19] sont cohérents avec nos résultats ; Ils ont utilisé de la laccase-glutaraldéhyde-fibre de noix de coco pour clarifier le jus de pomme, réduisant sa couleur originale de 61 %.
Bien que les polyphénols contenus dans les jus de fruits aient des effets nutritionnels et thérapeutiques positifs sur le corps humain, ils peuvent également réagir avec les protéines, provoquant un trouble, une sédimentation ou une turbidité du jus, altérant ainsi la saveur et l'arôme du produit et réduisant sa durée de conservation.71L’objectif de cette étude était de réduire de manière sûre la teneur en composés phénoliques du jus de pomme grâce à la laccase de Pleurotus ostreatus NRC 620. Les résultats présentés dans le tableau 1 montrent que la teneur totale en composés phénoliques du jus de pomme traité à la laccase a été significativement réduite avant le stockage à 4 °C. De plus, cette teneur a également diminué au cours du stockage dans les deux échantillons étudiés (tableau 1). (Références : Sandri et al.)72ont montré que le jus de pomme traité aux enzymes peut conserver son activité antioxydante et sa teneur en composés phénoliques. Cependant, les résultats d'une étude menée par Lettera et al.73démontrent que le traitement du jus d'orange avec de la laccase fongique peut réduire sa teneur en composés phénoliques jusqu'à 45 %.
Il a été démontré que les composés phénoliques possèdent des propriétés telles que la neutralisation des radicaux libres, la réduction et l'extinction de l'oxygène singulet, le transfert d'atomes d'hydrogène et le don d'électrons aux radicaux libres, ce qui en fait de puissants antioxydants.74Par conséquent, dans cette étude, les méthodes DPPH et FRAP ont été utilisées pour évaluer l'effet de la laccase sur l'activité antioxydante du jus de pomme conservé au réfrigérateur pendant 14 jours (tableau 2). Les deux méthodes ont montré une augmentation de l'activité antioxydante au cours de la conservation, ce qui pourrait être dû à une augmentation des composés phénoliques libres ou à la formation de produits de la réaction de Maillard (PRM), ces derniers étant vraisemblablement à l'origine de cette augmentation.75Les réactions de brunissement non enzymatiques (notamment la dégradation de l'acide ascorbique, les réactions de Maillard et la dégradation des sucres catalysée par les acides) produisent des pigments bruns (mélanoïdines). Les produits intermédiaires de dégradation de l'acide ascorbique et les produits de dégradation des sucres (tels que les composés carbonylés) peuvent réagir avec les acides aminés par le biais des réactions de Maillard.76Bien que le brunissement des fruits et légumes pendant le stockage ait fait l'objet de nombreuses études, notre compréhension de ces réactions reste limitée.77Comparativement à la méthode FRAP, le jus de pomme traité à la laccase a présenté une activité antioxydante significativement plus faible selon la méthode DPPH (tableau 2), et l'activité antioxydante de tous les échantillons a augmenté significativement avec la durée de conservation. Deux méthodes différentes de détermination de l'activité antioxydante ont été utilisées dans cette étude en raison de leurs principes distincts. La méthode DPPH mesure la capacité à neutraliser les radicaux libres, tandis que la méthode FRAP mesure la capacité à réduire les ions fer. Il est donc recommandé d'utiliser plusieurs méthodes pour déterminer l'activité antioxydante et ainsi mieux comprendre celle des échantillons étudiés.78
L'un des principaux résultats de cette étude est que la laccase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 présente une activité optimale à 70 °C et à un pH de 3,0. Comparée à d'autres laccases fongiques couramment utilisées pour la clarification des jus, telles que celles de *Trametes versicolor* et de *Ganoderma lucidum*, la laccase de *P. ostreatus* NRC 620 présente une stabilité thermique supérieure et un pH plus acide. Les laccases de *Trametes versicolor* et de *Ganoderma lucidum* présentent généralement une activité optimale entre 50 et 60 °C et à des pH compris entre 3,5 et 5,0. Cette différence pourrait contribuer à une meilleure efficacité de clarification des jus, notamment pour les jus acides où la stabilité à des pH plus faibles est essentielle. La laccase de *P. ostreatus* NRC 620, comparée aux autres laccases fongiques étudiées, présente la particularité de fonctionner efficacement dans des conditions plus difficiles. Sa température d'activité optimale plus élevée suggère des avantages potentiels pour les applications industrielles, tels que des vitesses de réaction plus rapides et une contamination microbienne réduite. Son faible pH, bien adapté à l'acidité de nombreux jus, pourrait être utile dans les procédés de clarification. Ces résultats justifient des recherches plus approfondies en vue d'une application à grande échelle, faisant de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 une alternative viable aux sources fongiques de laccase traditionnelles. Par rapport aux études précédentes, nous avons constaté que la température optimale est de 60 °C et le pH optimal de 3,0. Après une réaction à 60 °C pendant 80 minutes, la laccase de *Ganoderma lucidum* a conservé son activité.46% de son activité.79 Selon Kurniawati et Nicelle80Les enzymes de *Ganoderma lucidum* présentent une stabilité excellente à modérée à 25 °C et à des pH compris entre 5,0 et 8,0, ainsi qu'une stabilité à pH 6,0 et à des températures comprises entre 10 et 30 °C. Dans cette étude, nous avons déterminé que le pH et la température optimaux pour l'activité enzymatique de *Pleurotus ostreatus* étaient respectivement de 3,0 et 70 °C. Après une incubation de deux heures à 40 °C et 50 °C, l'enzyme conservait respectivement 68,33 % et 59,61 % de son activité. De plus, la laccase de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 a présenté une activité élevée sur une large plage de températures, de 50 °C à 80 °C, atteignant presque son activité maximale (69 % à 98 %), avec une activité maximale observée à 70 °C.
En conclusion, la laccase de pleurote NRC620, obtenue en conditions statiques, a démontré une activité et une stabilité optimales sur une large gamme de pH et de températures, faisant preuve d'une stabilité supérieure à celle d'autres sources enzymatiques. L'ajout de 10 mM de MgSO₄ et de CuSO₄ a augmenté l'activité enzymatique d'environ 21 % et 35 %, respectivement. Lors de l'incorporation dans le jus de pomme, l'enzyme a réduit le pH et la viscosité, tandis que la teneur en composés phénoliques n'a que légèrement diminué au cours du stockage.
Les résultats confirment le potentiel de la laccase dans l'industrie agroalimentaire, notamment pour la clarification des boissons. En décomposant spécifiquement les composés phénoliques, la laccase réduit la turbidité, améliore la limpidité et préserve la qualité des jus de fruits dans des conditions opératoires douces. Contrairement aux agents clarifiants traditionnels tels que la gélatine, la bentonite et le gel de silice, la laccase ne génère aucun déchet et conserve les arômes des boissons, ce qui en fait une option plus écologique et durable. De plus, comparée à d'autres enzymes et méthodes de filtration, la laccase offre une solution ciblée et économique, sans compromettre la qualité du produit.
Kyomuhimbo, HD et Brink, HG. Applications et stratégies d'immobilisation des laccases contenant du cuivre ; une revue. Heliyon 9, e13156 (2023).
Date de publication : 15 décembre 2025